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发布时间：2019-04-11 13:48    来源：国家市场监督管理总局

1  范围

    本方法规定了鳕鱼及其制品中裸盖鱼（Anoplopoma fimbria）、油鱼（Lepidocybium flavobrunneum，Ruvettus pretiosus）和南极犬牙鱼（Dissostichus eleginoides，Dissostichus mawsoni）源性成分的实时荧光PCR检测方法。

    本方法适用于鳕鱼、鳕鱼片、鳕鱼扒等生鲜或速冻鳕鱼产品（不包含鱼丸、鱼糕、鱼饼、鱼肠、鱼豆腐、鱼肝油等加工产品）中裸盖鱼、油鱼和南极犬牙鱼源性成分的定性检测。

2  原理

    使用商业化DNA提取试剂盒，获得适用于实时荧光PCR检测的DNA。分别使用裸盖鱼、油鱼或南极犬牙鱼特异性引物探针，通过实时荧光PCR反应，获得Ct值，根据Ct值判断样品是否检出裸盖鱼、油鱼或南极犬牙鱼源性成分。

3  试剂和材料

    除另有规定外，本方法中所用试剂均为分析纯，水应符合GB/T 6682的一级水要求。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。

3.1  引物探针序列

3.1.1  裸盖鱼源性成分NADH2基因

    裸盖鱼源成分5 ’端引物：5 ’-AGGGACCACCCTAACATTCG-3 ’

    裸盖鱼源性成分3 ’端引物：5 ’-GTGGGTGGTGATGCTGTGCT-3 ’

    裸盖鱼源性成分探针：5 ’-FAM-CAGCTCTCACTGACTACTCGCATGA-BHQ1-3 ’

3.1.2  油鱼源性成分Cytb基因

    油鱼源性成分5 ’端引物：5 ’-TAACTTCGGATGACTCATCCG-3 ’

    油鱼源性成分3 ’端引物：5 ’-AGTAAAGGCCTCGTCCAATGT-3 ’ 

    油鱼源性成分探针：5 ’-FAM-CATCCGAAACCTTCATGCAAACGGC-BHQ1-3 ’

3.1.3   南极犬牙鱼源性成分CK基因

    南极犬牙鱼源性成分5 ’端引物：5 ’-CTGAATATGTAGGTGCATACG-3 ’

    南极犬牙鱼源性成分3 ’端引物：5 ’-TTGCTCTTTGTGTTTCGGTT-3 ’

    南极犬牙鱼源性成分探针：5 ’-FAM-TCCATTAGGTAAGCGAGCGGGAAGA-BHQ1-3 ’

3.1.4  内参照基因真核生物18SrRNA 

    内参照5 ’端引物：5 ’-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3 ’

    内参照3 ’端引物：5 ’-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3 ’

    内参照探针：5 ’-FAM-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAAC-BHQ1-3 ’

3.2   商业化DNA提取试剂盒。

3.3   商业化PCR反应预混液。

4  仪器和设备

4.1  实时荧光PCR仪。

4.2  微量紫外分光光度计。

4.3  恒温水浴锅。

4.4  高速冷冻离心机：离心力18,000 g以上。

4.5  微量移液器（0.5 μL- 10 μL，10 μL- 100 μL，20 μL- 200 μL，100 μL- 1000 μL）。

4.6  涡旋振荡器。

4.7  天平：感量0.001 g。

5  分析步骤

5.1  样品前处理

（1）样品只有单块鱼肉组成：使用灭菌剪刀适量剪取中心部位鱼肉。

（2）样品有五块以下鱼肉组成：使用灭菌剪刀适量剪取每个组成部分的中心部位鱼肉。

（3）样品有五块以上鱼肉组成：随机挑选5块鱼肉，使用灭菌剪刀适量剪取每个组成部分的中心部位鱼肉。

    将所取得的鱼肉使用灭菌去离子水洗涤，离心去除上清液，尽可能剪碎并混匀。

    注：速冻鳕鱼产品应在完全解冻后再取样。

5.2  DNA提取

    按照商业化DNA提取试剂盒说明书中要求的取样量称取样品，每个样品设置两个平行，按照商业化DNA提取试剂盒说明书操作。

5.3  DNA浓度测定

    取1 μL DNA溶液，使用微量紫外分光光度计按照dsDNA（双链DNA）计算方式检测其浓度。

5.4  实时荧光PCR扩增

    实时荧光PCR反应体系见表1。

                          表1 实时荧光PCR反应体系

    PCR反应程序：95 ℃ 15 s； 95 ℃ 5 s， 60 ℃ 34 s（读取荧光），40个循环。

5.5  实验对照

    分别设置阳性对照、阴性对照、PCR空白对照、空白提取对照各一个。

    阳性对照：含相应物种的DNA。

    阴性对照：不含相应物种的DNA。

    PCR空白对照：以灭菌去离子水替代DNA加入实时荧光PCR反应体系。

    空白提取对照：以灭菌去离子水替代样品进行DNA提取。

6  结果判断与表述

6.1  质量控制

   若以下条件的其中一条不满足要求时，结果视为无效：

   阳性对照：荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值＜30.0；

   阴性对照：Ct值≥35.0；

   PCR空白对照：Ct值≥35.0；

  空白提取对照：Ct值≥35.0；

  内参照反应：荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值＜30.0；

  样品平行反应：Ct值经6.2结果判定后应一致。

6.2  结果判定

    （1）如Ct值＜30.0，且质量控制符合要求，则判定为检出相应物种源性成分。

    （2）如Ct值≥30.0，且质量控制符合要求，则判定为未检出相应物种源性成分。

6.3  结果表述

    检出 XXX 源性成分。

    未检出 XXX 源性成分。

7  防污染措施

    检测过程中放置交叉污染的措施按照GB/T 27403中的规定执行。

8 方法检出限

    裸盖鱼引物探针检出限范围为0.1 %~5 %，油鱼引物探针检出限范围为1 %~10 %，南极犬牙鱼引物探针检出限范围为1 %~2 %。

    注：因使用的设备、试剂盒不同，其检出限有所差异。

责任编辑：小雪